Die Handlung beginnt, als Bruce Wayne im Arkham City eingesperrt wird, einem abgelegenen Gebiet von Gotham, das in eine offene Haftanstalt umgewandelt wurde und unter der Kontrolle von Professor Hugo Strange steht. Strange kennt die Identität von Batman und plant, das Protocol 10 zu aktivieren, einen Plan zur Massenvernichtung der Insassen. Gleichzeitig vergiftet der Joker, der durch seine eigene Titan-Formel kontaminiert ist, Batman mit seinem Blut, was ihn zwingt, eine Heilung zu finden.

Während Batman ermittelt, begegnet er vielen ikonischen Feinden wie Two-Face, Penguin, Mr. Freeze, Harley Quinn, Riddler und Ra’s al Ghul. Die Geschichte gipfelt in der Enthüllung, dass Protocol 10 ein Genozid-Plan ist, und im finalen Kampf gegen den Joker, der stirbt, als die Heilung zerstört wird. Das Spiel endet damit, dass Batman den leblosen Körper des Jokers aus Arkham City trägt, in einer der dramatischsten Szenen der Serie.